Проекты

Краткое описание

Серьезной проблемой лесного хозяйства, природоохранных органов и органов правопорядка является оборот нелегальной древесины. Одним из потенциальных путей определения места происхождения образцов нелегальных лесоматериалов является сравнение генотипов образцов древесины с предварительно описанной географической структурой генетической изменчивости данного вида и идентификация популяций, генетически наиболее сходных с анализируемыми образцами. Для этого требуется вначале разработать набор изменчивых генетических маркеров, затем исследовать с их помощью пространственную генетическую структуру с необходимым уровнем географической подробности и после этого использовать эти маркеры для исследования образцов предполагаемой нелегальной продукции, сравнивая их с географической структурой, подбирая для каждого образца генетически наиболее близкий географический район. Но особенности биологии видов хвойных таковы, что на протяжении тысяч километров их популяции по ядерным генам являются генетически крайне однородными из-за способности пыльцы распространяться на большие расстояния и нивелировать различия между популяциями. В отличие от ядерной ДНК, митохондриальная ДНК передается потомку только от материнского дерева и распространяется только с семенами, имеющими гораздо меньшую летучесть, чем пыльца. Результатом этого является значительно более выраженная географическая неоднородность генетической структуры по митохондриальным маркерам, которая может использоваться для идентификации места происхождения образца. Эффективными генетическими маркерами являются тандемные повторы - микросателлитные и минисателлитные локусы, многочисленные как в ядерном, так и в митохондриальном геноме. Следовательно, для идентификации места происхождения образца древесины целесообразно использовать микросателлиты и минисателлиты митохондриального генома. Для разработки мини- и микросателлитных локусов обычно используются тандемные повторы, найденные в геномных сиквенсах. Для митохондриальных геномов большинства видов хвойных видов в базах данных имеются сиквенсы, полученные с помощью коротких ридов прибора ILLUMINA, длиной 150 – 300 п.н. Однако, длинные тандемные повторы, наиболее подходящие для разработки минисателлитных маркеров, часто превосходят про длине длину отдельного рида и поэтому почти не попадают в геномные сборки. Для некоторых видов, например, Picea abies и Larix sibirica имеются геномные сборки, созданные с использованием длинных ридов, длиной десятки тысяч п.н. и полученные с помощью технологий секвенирования третьего поколения – Oxford Nanopore или PacBio. На их основе ранее были разработаны минисателлитные и микросателлитные маркеры для лиственницы сибирской, ели европейской и сибирской. Их высокая изменчивость позволяет выявлять тонкую генетическую структуру даже в пределах локальных популяций. Однако для других хвойных, таких как сосны обыкновенная и сибирская, сиквенсы на основе длинных ридов все еще отсутствуют.
В данной работе я предлагаю выполнить первую часть работы – разработать высокоизменчивые митохондриальные маркеры, т.е. провести геномное секвенирование с использованием Oxford Nanopore митохондриальных геномов сосен обыкновенной и сибирской, выявить в них протяженные участки минисателлитов и микросателлитов, разработать для них ПЦР праймеры и оценить возможность описания, с помощью последних, пространственной генетической структуры и использования их для идентификации происхождения образцов. Далее останется исследовать географическую структуру их изменчивости на российской части ареала указанных видов, для того, чтобы иметь возможность сравнения анализируемых образцов с популяциями конкретных регионов (что не входит в задачи данного проекта).
Я планирую выделить высокомолекулярную геномную ДНК из одного образца сосны обыкновенной и одного образца сосны сибирской, провести секвенирование с использованием прибора MinION (Oxford Nanopor), провести сборку контиг на основе длинных ридов MinION и имеющихся коротких ридов ILLUMINA, имеющихся в базах данных таких как GenBank), отобрать из них контиги, относящиеся к митохондриальному геному и аннотировать митохлондриальный геном указанных двух видов. Далее, я намерен выявить в указанных последовательностях минисателлитные и микросателлитные локусы, содержащие наибольшее число повторов (оптимально 10 и более) и разработать для их амплификации ПЦР праймеры. Далее необходимо будет протестировать данные локусы на небольших выборках из географически удаленных популяций в отношении их полиморфизма, выраженной географической структуры, отсутствия неспецифичной амплификации, минимального уровня нуль-аллелей и отобрав в итоге 5 – 10 наиболее перспективных локусов для каждого вида. Для выполнения данной работы требуется 18 месяцев.